|
|
Structural Studies on Extracellular Domains of adhesion G Protein-Coupled Receptor ADGRG4
Strnadová, Martina ; Márová, Ivana (referee) ; Mravec, Filip (advisor)
Bunková komunikácia je schopnosť buniek príjmať, vysielať a spracovávať signály zo svojho okolia. Môžeme teda hovoriť o komunikácii medzi bunkami a orgamizmom. Extracelulárne stimuly spúšťajú signál, ktorý interaguje s receptormi na bunkovom povrchu, čo má za následok aktiváciu intracelulárnych signálnych proteínov. Tieto proteíny sú rozdelené do viacerých rodín podľa ich špecifickej sekvencie, domén ktoré obsahujú, alebo ligandov, s ktorými interagujú. Jednou z týchto rodín je práve receptorová rodina adhezívnych receptorov spojených s G proteínom (aGPCR), ktorá obsahuje 33 členov. Najnovšie štúdie naznačujú, že fungujú z veľkej časti ako mechanoreceptory; avšak, pre niektorých členov boli identifikované aj ligandy pre ich aktiváciu. V porovnaní s inými GPCR sa táto rodina vyznačuje relatívne dlhou extracelulárnou oblasťou (ECR), ktorá obsahuje súbor rozličných štruktúrnych domén a motívov. ADGRG4 (GPR112) predstavuje jeden z najväčších aGPCR s dĺžkou reťazca väčšou ako 3000 aminokyselín (aa). Väčšina jeho reťazca aa sa nachádza v extracelulárnom priestore (viac ako 2500 aa). Je známe, že ADGRG4 je špecificky exprimovaný v enterochromafinných bunkách umiestnených v epiteli ľudského tenkého čreva. Tieto enteroendokrinné bunky sú zodpovedné za produkciu a sekréciu serotonínu a reagujú na chemické a mechanické podnety. K dnešnému dňu však fyziologická funkcia ADGRG4 v týchto bunkách zostáva neznáma. Cieľ tejto práce bol rozdelený na dve časti. V prvej časti bola snaha o poskytnutie štruktúrnych informácií o obrovskej extracelulárnej oblasti ADGRG4. ECR bola rozdelená na viacero častí pre lepšie skúmanie. Následne boli vzorky exprimované v ľudských embryonálnych obličkových bunkách 293 (HEK293S bunky). Výsledné proteínové štruktúry boli purifikované viacerými technikami. Pre zvýšenie možnosti kryštalizácie, bol purifikovaný proteín deglykozylovaný a až potom podrobený na kryštalizačné pokusy. Druhá časť sa zaoberala analýzou NTF-konštruktov, dobre preskúmaných ADGRs. Tieto konštrukty neobsahovali C-terminálny koniec (CTF), iba N-terminálnu časť (NTF). Desať rôznych proteínov bolo úspešne naklonovaných a expresovaných v HEK293T bunkách. Na vyhodnotenie výsledkov oligomerného stavu vzoriek z prvej aj druhej časti boli použité techniky Native PAGE a dynamický rozptyl svetla (DLS). Ako kontrola autoproteolýzy, ktorá je typickým znakom aGPCR, sa využili rozličné techniky Western blotting (WB). Metóda nano-diferenciačná skenovacia fluorescencia (DSF) sa využila na stanovenie pripravených konštruktov a na nájdenie optimálnych podmienok pre roztoky, ktoré sa v práci používali. Výsledky z prvej časti ukazujú za akých podmienok dokážeme nami vytvorený konštruk podrobiť kryštalizácii a následne ďalej pokračovať v jeho výskume. Druhá časť nám ukázala, ktoré nami klonované konštrukty sa dokážu stabilne expresovať v HEK293T bunkách. Na základe získaných parametrov z prvej a druhej časti dokáže výskum v tejto oblasti rozšíriť a do buducnosti získať dôležité informácie ohľadom týchto pozoruhodných receptorov.
|
guest ::
